In this video we will learn how to perform all phases of a Western Blot using the

このアッセイのための最も一般的な方法。 我々はブロットの準備を開始する前に、まず私たちのサンプル溶解液を準備する必要があります。

most common methods for this assay.

この例では、培養細胞からタンパク質溶解物をご用意しております。 ここで 私たちは、氷冷PBSで細胞を2回洗浄

Before we can start preparing the blot we must first prepare our sample lysate.

細胞をカバーするために、十分な溶解バッファー。 溶解緩衝液の選択は、主としてあなたに依存

In this example we will prepare a protein lysate from cultured cells.

目的のタンパク質の選択。 我々は、細胞をこすり、遠心管に細胞溶液を移す 氷上に置いた。 膜結合タンパク質を可溶化するために、我々はより強く必要となります

Here

抽出用洗剤は、単離された細胞質タンパク質に比べて。 この例では、 我々は標準的なRIPA緩衝液を使用している、

we wash the cells twice with ice cold PBS

これは最大のタンパク質収量を得るための一般的なバッファです。抽出中 すべての細胞のローカライズからのタンパク質、

and enough lysis buffer to cover the cells.

それはあなたの溶解緩衝液中のプロテアーゼ阻害剤を含めることが非常に重要となるでしょう あなたのサンプルの劣化を防ぐ。常に作りたてのプロテアーゼを使用する

The choice of lysis buffer depends largely on your

阻害剤は、氷の上に試料を保持し、迅速に作業。 我々上下にピペッティングにより細胞をシラミ

choice of protein of interest.

氷上で30分間インキュベートした。 その後、ペレットに細胞を遠心分離する。

We scrape the cells and transfer the cell solution on a centrifuge tube

ペレットを捨て、上清を回収する。これはあなたのライセートです。 あなたのタンパク質溶解物の総濃度を決定することで

placed on ice.

あなたのライセートの小さな部分をテスト 市販のタンパク質定量アッセイで

In order to solubilize membrane bound proteins, we will require stronger

そのようなBCAなど。 これはあなたのゲルに等量のタンパク質をロードする際に役立つことでしょう。 ウェスタンブロットは、一般的に還元され、変性の下にあらかじめ形成されています

extraction detergents compared to isolated cytoplasmic proteins.

条件。これらの条件は、タンパク質はそのことによって分離することができるようになります 分子量 母国配座形状や電荷ではなく。

In this example

サンプルを削減し、変性させ、 このような従来のLaemmliバッファーとしてローディングバッファー内の各希釈します。

we are using a standard RIPA buffer,

このバッファは、ジスルフィド尾根を低減するために、β-メルカプトエタノール、またはDTTが含まれています システイン間、 正味の負のタンパク質を変性させることを支援するため、SDS、

which is a common buffer for obtaining maximum protein yield. While extracting

グリセロールのサンプルが各ウェルにシンクできるようにするには、 ライセートと象徴的なバッファを可視化するブロモフェノールブルー。

proteins from all cellular localizations,

Votex 5分のために摂氏95度で、各サンプル 完全にタンパク質を変性。今、あなたのサンプルをロードする準備が整いました

it is very important to include protease inhibitors in your lysis buffer which will

SDS PAGEゲルに。 この次のステップのために我々は、サンプル中の個々のタンパク質を分離します 溶解物 それらの分子量に基づいて、

prevent degradation of your sample. Always use freshly prepared protease

負に荷電したタンパク質を引き付けるために正極を用いた。 これを行うには 我々は、市販に我々の先に調製したタンパク質サンプルを読み込む

inhibitors, keep samples on ice and work quickly.

ポリアクリルアミドゲル。 ゲルは、アクリルアミドの一定のパーセンテージまたはグラデーションで利用可能です。 ゲルのアクリルアミド割合が小さく高い

We lice the cells by pipetting up and down

パーセンテージ。 したがって高い割合ゲルは低量のタンパク質のためのより良いですが、割合が低い 大量のタンパク質と勾配ゲルを使用することができるためゲルが優れている

followed by incubation on ice for 30 minutes.

すべてのサイズのタンパク質 細孔径でのさまざまな範囲に起因する。 電気泳動装置に挿入してあなたのゲルを調製し、

Then centrifuge the cells into a pellet.

あなたのゲル化学のために適切である、ランニングバッファーを充填。 ランニングバッファーでゲルのウェルをすすぎにバッファを追加

Discard the pellet and collect the supernatant. This is your lysate.

チャンバー。 ウェルにあなたのサンプルをロードします。 あなたは、ロードする量がわからない場合は、

Determine the total concentration of your protein lysate by

全タンパク質の10〜30マイクログラムが示唆出発点です 同様にロードされたサンプルの全体量として。

testing a small portion of your lysate

また、予め染色分子量のためによく、少なくとも1を確保する必要があります はしご。 はしごは、中にタンパク質の分離を監視することができます

with a commercially available protein quantitation assay

電気泳動し、その後中に試料中のタンパク質の重量を確認する 後で分析する。 電気泳動装置を閉じて、電源に接続します。ほとんどのユニット

such as the BCA.

典型的には、200ボルトで45〜60分を実行 またはローディングバッファーがゲルの底に到達するまで。

This will assist you in loading equal amounts of protein into your gel.

この時間の間に、各試料中の負に帯電したタンパク質は、向かって移行します ポリアクリルアミドを介して自分の道を作って正に帯電電極

Western Blots are typically preformed under reduced and denatured

ゲルマトリックス。 この次のステップでは、ゲルのうち、当社の個別のタンパク質を転送します と固体膜またはブロットに。 これは前のステップと同じ元本に基づいている

conditions. These conditions will allow proteins to be separate by their

その中で電界が負のタンパク質を除去するために充電され 正極に向かって。 転送が濡れていたり、半乾燥条件下で発生する可能性があります。

molecular weight

ここでは、従来の湿式転写法のデモンストレーションを行います。除去することによって開始 そのカセットからゲル 井戸を含む上部を切断。

rather than their native conformational shape or charge.

指示されたゲルの向き左上隅をノッチ。 転送サンドイッチを準備しながら転写バッファーでゲルをフロートさせます。

To reduce and denature samples,

転送サンドイッチを作るには、 あなたは、カセットが必要になります

dilute each in a loading buffer such as the traditional laemmli buffer.

スポンジ、濾紙 ゲル とPVDFまたはnitrocellulous膜のいずれかのあなたの選択。 PVDFは最初にエタノールに膜を浸漬することによって、アクティブにする必要があります

This buffer contains beta-mercaptoethanol, or DTT, to reduce disulfide ridges

2分。しかし、このPVDFまたはnitrocellulousの選択以外の 膜は、個人的な好みです。 ブロットの方向を示すために、左上隅にノッチ

between cysteines,

そして10分間転写バッファーでメンブレンをインキュベートする。 次のコンポーネントを配置することによってスタックを作成

SDS to assist denaturing a net negative protein,

黒の負極から正極に赤： スポンジ、 ろ紙、 膜、 （素手でゲルやメンブレンに触れて使用しないように注意してください

glycerol to allow the samples to sink into each well,

清潔なピンセットやスパチュラ代わりに。 どの段階で膜に触れると、ブロットを汚染する可能性があります

bromophenol blue to visualize the lysate and an iconic buffer.

過度のバックグラウンド信号。 ） ろ紙 とスポンジ。 優しくする可能性のある泡をロールアウトする各レイヤでクリーンローラーを使用して

Votex each sample at 95 degrees Celsius for five minutes to

現在 気泡が効率的なタンパク質転移を阻害することになるからです。 カセットをロックし、風邪を含む装置に置き

completely denature the proteins. You are now ready to load your samples

転送バッファ カセットが正しくマイナスからプラスに配置されることを保証する。 熱の蓄積を防止するためには、寒さで転送するために有益である

into an SDS page gel.

装置内のパック 装置やチャンバーの下部に配置スピナーバー付き寒い部屋インチ チャンバーを閉じて、電源に接続します。

For this next step we will separate the individual proteins in our sample

あるメーカーの指示に従って転送を実行 三〇から一二〇分間、通常100ボルト。

lysate

膜への我々のタンパク質のエレクトロ後、我々は意志 今、ブロットをブロック 興味のある私たちのタンパク質の一次抗体の特定を適用してから、セカンダリ

based upon their molecular weight

一次抗体を認識する抗体。 カセットから膜を除去し、水で3回洗浄することによって開始します。 オプションのステップとして、我々は、タンパク質が正常に転送されたかどうかを確認することができます

using a positive electrode to attract a negatively charged protein.

ポンソー赤色で膜を染色することにより、。 5分間ポンソーで膜をインキュベートとなるまで水で洗う

To do this

バンドがはっきりしている。 検証後 ブロットは、その後、水で洗い流しを継続することにより、脱染色することができる

we load our previously prepared protein samples into a commercially available

TBSより糸または 色素が完全に除去されるまで。 我々は、タンパク質を含まないブロットのすべての領域をブロックする必要があります。

polyacrylamide gel.

これは、抗体の非特異的結合を防ぎ、全体的な削減します バックグラウンド信号。 一般的なブロッキングバッファーは、アッセイのための5％脱脂粉乳を含む

Gels are available in fixed percentages or gradients of acrylamide.

TBSのより糸ソリューションインチ リン酸化特異的抗体でプローブするときしかし、牛乳を使用していない

The higher the acrylamide the smaller the proportion of gel

それはセシウム、その内因性リン酸化タンパク質から高いバックグラウンドの原因となりますので。 室温で1時間ブロッキング液で膜をインキュベート

percentage.

温度 わずかな撹拌下。 ブロッキング液を除去し、5分間TBSより糸で洗ってください。 今、私たちは抗体を追加する準備が整いました。一次抗体を希釈

Therefore higher percentage gels are better for low weight proteins, low percentage

データシートに推奨濃度でブロッキングバッファーを。 穏やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートする。

gels are better for large weight proteins and gradient gels can be used for

推奨されるオプションのステップはまた、陽性コントロール抗体を使用することです ユーザーは合計等量のタンパク質を確認することを可能にするに読み込まれました

proteins of all sizes

いずれかを削除することで、トラブルシューティングの各ウェルと側近 ウェスタンブロットの手順で不確実。

due to their varying range in pore size.

翌日、 一次抗体をオフにデカントし、大容量ボリュームを持つメンブレンを洗浄 TBSのより糸と激しい撹拌の 5分ごとに5回。

Prepare your gel by inserting it into the electrophoresis apparatus and

これらの厳格な洗浄は、非特異的な除去に非常に重要である バックグラウンド信号。 洗浄後、ブロッキング溶液中で二次抗体を希釈し、インキュベート

filling with running buffer that is appropriate for your gel chemistry.

濃度で室温で1時間のための膜 データシートをお勧めします。 今回の例では二次は後にもHRPに共役である

Rinse the wells of the gel with running buffer and add buffer to the

検出。 デカント膜とでTBSのより糸、大量の二次洗浄 5分ごとに、激しく撹拌しながら5回。

chambers.

これで、検出フェーズの準備ができている。 この最終段階では、我々は、最も一般的な信号を使用して開発のデモンストレーションを行います

Load your samples into the wells.

最も敏感で、最も安価な検出法、電気化学発光 （またはECL）反応。 この方法では、複合体中の酵素を利用

If you are unsure of the amount to load,

これはECL反応を触媒し、生成する二次的に結合させた 光。 次に、光はX線フィルム上に集まって開発されています

10-30 micrograms of total protein is a suggested starting point

または十分に敏感な特殊なカメラを用いてデジタル化 このアプリケーションの。 私たちは、一対一の比率で等分にECL試薬を混合することにより開始

as well as the entire amount of sample loaded.

メーカーの指示に従って。 我々は動揺することなく、3〜5分間メンブレンをインキュベートします。 インキュベーション後、デカントのECL混合物と過剰を拭き取るワイプ実験室を使用する

You will also need to reserve at least one well for prestained molecular weight

膜の隅からソリューションを提供します。 このよう防止するためのシートプロテクターとして透明なプラスチックのラップで膜を置きます

ladder.

乾燥。膜が完全に乾燥させることは避けてください。 私たちは、今どんな気泡や余分なソリューションを押し出すためにローラーを使用することができます。

The ladder will allow you to monitor protein separation during

直ちに膜を開発。 フィルムとカメラの両方のシステムでは、手動で露出時間を調整することができます 画像完璧なウエスタンブロットを確保するためである。

electrophoresis and subsequently verify protein weight in your sample during

相対バンド密度は、現在市販されて良く定量することができる ソフトウェア。 。適切な分子量はまた、バンドのサイズを比較することによって確認できます

later analysis.

分子量のはしご。

Close the electrophoresis unit and connect it to a power supply. Most units

typically run 45-60 minutes at 200 volts

or until the loading buffer reaches the bottom of the gel.

During this time the negatively charged proteins in each sample will migrate toward

the positively charged electrode making their way through the polyacrylamide

gel matrix.

In this next step, we will transfer our separate proteins out of the gel

and into a solid membrane or blot.

This is based upon the same principal as the previous step

in which an electric field is charged to remove the negative proteins

towards a positive electrode.

Transfer can occur under wet or semi-dry conditions.

Here we will demonstrate the traditional wet transfer method. Start by removing

the gel from its cassette

cutting the top portion containing the wells.

Notch the top left corner to indicated gel orientation.

Float the gel in transfer buffer while preparing the transfer sandwich.

To make the transfer sandwich

you will need a cassette,

sponge, filter paper

the gel

and your choice of either PVDF or nitrocellulous membrane.

PVDF must first be activated by soaking the membrane in ethanol for

two minutes. But other than this the PVDF or choice of nitrocellulous

membrane is a personal preference.

Notch the top left corner to indicate blot orientation

and incubate membranes in transfer buffer for 10 minutes.

Create a stack by placing the following components

from the black negative cathode to red positive anode:

sponge,

filter paper,

membrane,

(Be careful not to touch the gel or membrane with your bare hands and use

clean tweezers or spatula instead.

Touching the membrane during any phase can contaminate the blot and lead to

excessive background signal. ),

filter paper

and sponge.

Use a clean roller with each layer to gently roll out any bubbles that may be

present

since bubbles will inhibit efficient protein transfer.

Lock the cassette and place it in the apparatus containing cold

transfer buffer

ensuring that the cassette is properly positioned from negative to positive.

In order to prevent heat buildup, it is beneficial to transfer with a cold

pack in the apparatus

apparatus or in a cold room with the spinner bar placed at the bottom of the chamber.

Close the chamber and connect to a power supply.

Perform the transfer according to the manufacturer's instructions which is

normally 100 volts for thirty to one hundred and twenty minutes.

After electrotransfer of our proteins to a membrane, we will

now block the blot,

apply a primary antibody specific for our protein of interest and then a secondary

antibody which will recognize the primary antibody.

Start by removing the membrane from the cassette and rinsing three times in water.

As an optional step, we can verify the proteins were transferred successfully

by staining the membrane with ponceau red.

Incubate the membrane in ponceau for five minutes and wash with water until

the bands are clear.

After verification

the blot can then be de-stained by continuing to wash with water

or TBS twine

until the dye is completely removed.

We need to block all areas of the blot which do not contain protein.

This will prevent non-specific binding of the antibody and reduce overall

background signal.

Common blocking buffers include 5% non-fat dry milk for the assay

in a TBS-Tween solution.

However do not use a milk solution when probing with phosphor-specific antibodies

as it can cause high background from its endogenous phosphoprotein, casein

Incubate the membrane with blocking solution for one hour at room

temperature

under slight agitation.

Decant the blocking solution and wash with TBS twine for five minutes.

We are now ready to add our antibody. Dilute the primary antibody in a

blocking buffer at the concentration recommended on the datasheet.

Incubate overnight at 4 degrees Celsius with gentle shaking.

A recommended optional step is to also use a positive control antibody

which allows the user to verify equal amounts of total protein were loaded into

each well and aides in troubleshooting by removing any

uncertainties with the Western Blot procedure.

The next day,

decant off the primary antibody and wash the membrane with large volumes

of TBS twine and vigorous agitation

five times for five minutes each.

These stringent washes are extremely important for removing non-specific

background signals.

After washing, dilute the secondary antibody in blocking solution and incubate

the membrane for one hour at room temperature at the concentration

recommended on the datasheet.

In our example the secondary is also conjugated to HRP for later

detection.

Decant membrane and wash secondary with large volumes of TBS twine with

vigorous agitation five times for five minutes each.

You are now ready for the detection phase.

In this final phase, we will demonstrate signal development using the most common,

most sensitive and most inexpensive detection method the electrochemiluminescence

(or ECL) reaction.

This method utilizes the HRP enzyme,

which was conjugated to the secondary to catalyze the ECL reaction and produce

light.

A light is then gathered onto x-ray film and developed

or digitized with the aid of a specialized camera sensitive enough

for this application.

We start by mixing equal parts ECL reagents in a one-to-one ratio

according to the manufacturer's instructions.

We will incubate the membrane for 3-5 minutes without agitation.

After incubation, decant ECL mixture and use a laboratory wipe to wipe off excess

solution from the corner of the membrane.

Place the membrane in a clear plastic wrap such as a sheet protector to prevent

drying. Avoid letting the membrane completely dry out.

We can now use a roller to push out any bubbles or any excess solution.

Immediately develop the membrane.

Both film and camera systems allow you to manually adjust the exposure time

in order to ensure a picture perfect Western Blot.

Relative band densities can now be quantified with commercially available

software.

. Proper molecular weight can also be verified by comparing band sizes to the

molecular weight ladder.