blot,

これは、一次抗体を認識します。 カセットから膜を除去し、中で3回洗浄することにより開始

apply a primary antibody specific for our protein of interest and then a secondary antibody

水。 オプションのステップとして、我々は、タンパク質が正常に転送されたかどうかを確認することができます ポンソー赤色で膜を染色することにより、。

which will recognize the primary antibody.

5分間ポンソーで膜をインキュベートとなるまで水で洗う バンドがはっきりしている。 検証後ブロットは、その後で洗浄し続けることで、脱染色することができる

Start by removing the membrane from the cassette and rinsing three times in

水またはTBSより糸は色素まで完全に除去される。 我々は既に、タンパク質を含まないブロットのすべての領域をブロックする必要があります。

water.

これは、抗体の非特異的結合を防ぎ、全体的な削減します バックグラウンド信号。 一般的なブロッキングバッファーは、アッセイのための5％脱脂粉乳を含む

As an optional step, we can verify the proteins were transferred successfully

TBSのより糸ソリューションインチ リン酸化特異的抗体でプローブするときそれができるようにしかし、牛乳を使用していない

by staining the membrane with ponceau red.

セシウム、その内因性リン酸化タンパク質から高いバックグラウンドを引き起こす。 室温で1時間ブロッキング溶液で膜をインキュベート

Incubate the membrane in ponceau for five minutes and wash with water until

わずかな撹拌下。 ブロッキング液を除去し、5分間TBSより糸で洗ってください。 今、私たちは抗体を追加する準備が整いました。一次抗体を希釈

the bands are clear.

データシートに推奨濃度でブロッキングバッファーを。 穏やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートする。

After verification the blot can then be de-stained by continuing to wash with

推奨されるオプションのステップはまた、抗体をロードポジティブコントロールを使用することです ユーザーは合計等量のタンパク質を確認することを可能にする各々にロードされた

water or TBS twine until the dye is completely removed.

よく、任意の不確実性を除去することによって、トラブルシューティングに側近 ウェスタンブロットの手順で。翌日、一次抗体オフデカントと

We need to block all areas of the blot which do not already contain protein.

TBSのより糸と激しく攪拌し、大量のメンブレンを洗浄 5分ごとに5回。 これらの厳格な洗浄は、非特異的な除去に非常に重要である

This will prevent non-specific binding of the antibody and reduce overall

バックグラウンド信号。 洗浄後、ブロッキング溶液中で二次抗体を希釈し、 濃度で室温で1時間メンブレンをインキュベート

background signal.

データシートをお勧めします。 今回の例では二次は後にもHRPに共役である

Common blocking buffers include 5% non-fat dry milk for the assay

検出。 デカント膜とでTBSのより糸、大量の二次洗浄 5分ごとに、激しく撹拌しながら5回。これで準備ができている

in a TBS-Tween solution.

検出フェーズ。

However do not use a milk solution when probing with phosphor-specific antibodies as it can

cause high background from its endogenous phosphoprotein, casein.

Incubate the membrane with blocking solution for one hour at room temperature

under slight agitation.

Decant the blocking solution and wash with TBS twine for five minutes.

We are now ready to add our antibody. Dilute the primary antibody in a

blocking buffer at the concentration recommended on the datasheet.

Incubate overnight at 4 degrees Celsius with gentle shaking.

A recommended optional step is to also use a positive control loaded antibody

which allows the user to verify equal amounts of total protein were loaded into each

well and aides in troubleshooting by removing any uncertainties

with the Western Blot procedure. The next day, decant off the primary antibody and

wash the membrane with large volumes of TBS twine and vigorous agitation

five times for five minutes each.

These stringent washes are extremely important for removing non-specific

background signals.

After washing, dilute the secondary antibody in blocking solution and

incubate the membrane for one hour at room temperature at the concentration

recommended on the datasheet.

In our example the secondary is also conjugated to HRP for later

detection.

Decant membrane and wash secondary with large volumes of TBS twine with

vigorous agitation five times for five minutes each. You are now ready for the

detection phase.