In this video we will learn how to perform all phases of a Western Blot using the

このアッセイのための最も一般的な方法。 我々はブロットの準備を開始する前に、まず私たちのサンプル溶解液を準備する必要があります。

most common methods for this assay.

この例では、培養細胞からタンパク質溶解物をご用意しております。 ここでは、氷冷PBSと十分な溶解緩衝液で細胞を2回洗浄

Before we can start preparing the blot we must first prepare our sample lysate.

セルをカバーする。 溶解緩衝液の選択は、ローカライゼーションに大きく依存 目的タンパク質の。 我々は、細胞をこすり、遠心管に細胞溶液を移す

In this example we will prepare a protein lysate from cultured cells.

氷上に置いた。 膜結合タンパク質を可溶化するために、我々はより強く必要となります 抽出用洗剤は、単離された細胞質タンパク質に比べて。

Here we wash the cells twice with ice cold PBS and enough lysis buffer

この例では、一般的なバッファである標準RIPA緩衝液を使用している 最大のタンパク質収量を得るため。すべてからタンパク質を抽出しながら

to cover the cells.

細胞の局在、 それはあなたの溶解緩衝液中のプロテアーゼ阻害剤を含めることが非常に重要となるでしょう あなたのサンプルの劣化を防ぐ。常に作りたてのプロテアーゼを使用する

The choice of lysis buffer depends largely upon the localization

阻害剤は、氷の上に試料を保持し、迅速に作業。 我々上下にピペッティングにより細胞をシラミ

of your protein of interest.

30分間氷上でインキュベートした。 その後、ペレットに細胞を遠心分離する。

We scrape the cells and transfer the cell solution on a centrifuge tube

ペレットを捨て、上清を回収する。これはあなたのライセートです。 することにより、サンプル溶解液の総タンパク質濃度を決定

placed on ice.

市販のタンパク質とライセートの小さな部分をテスト そのようなBCAとして定量分析。

In order to solubilize membrane bound proteins, we will require stronger

これはあなたのゲルに等量のタンパク質をロードする際に役立つことでしょう。 ウェスタンブロットは、伝統的に減少し、そして変性下であらかじめ形成されています

extraction detergents compared to isolated cytoplasmic proteins.

条件。 これらの条件は、タンパク質はその分子量によって分離することができるようになります 母国配座形状や電荷ではなく。

In this example we are using a standard RIPA buffer, which is a common buffer

サンプルを削減し、変性させ、 このような従来のLaemmliバッファーとしてローディングバッファー内の各希釈します。

for obtaining maximum protein yield. While extracting proteins from all

このバッファは、ジスルフィドを低減するために、β-メルカプトエタノール、またはDTTが含まれています システイン間の尾根、 SDSは、正味の負のタンパク質を提供変性支援する

cellular localizations,

グリセロールのサンプルが各ウェルにシンクできるようにするには、 ライセートを可視化するためのブロモフェノールブルー

it is very important to include protease inhibitors in your lysis buffer which will

象徴的なバッファ。 Votex 5分のために摂氏95度で各サンプルとインキュベート 完全にタンパク質を変性。あなたは今にあなたのサンプルをロードする準備が整いました

prevent degradation of your sample. Always use freshly prepared protease

SDS-PAGEゲル。

inhibitors, keep samples on ice and work quickly.

We lice the cells by pipetting up and down

followed by incubation on ice for thirty minutes.

Then centrifuge the cells into a pellet.

Discard the pellet and collect the supernatant. This is your lysate.

Determine the total protein concentration of your sample lysate by

testing a small portion of the lysate with a commercially available protein

quantitation assay such as the BCA.

This will assist you in loading equal amounts of protein into your gel.

Western Blots are traditionally preformed under reduced and denatured

conditions.

These conditions will allow proteins to be separate by their molecular weight

rather than their native conformational shape or charge.

To reduce and denature samples,

dilute each in a loading buffer such as the traditional laemmli buffer.

This buffer contains beta-mercaptoethanol, or DTT, to reduce disulfide

ridges between cysteines,

SDS to assist denaturing a provide a net negative protein,

glycerol to allow the samples to sink into each well,

bromophenol blue to visualize the lysate

and an iconic buffer.

Votex each sample and incubate at 95 degrees Celsius for five minutes to

completely denature the proteins. You are now ready to load your samples into an

SDS page gel.