in the Waters Peptide and Protein Bioanalysis Boot Camp.

短期集中講座の次章へようこそ

My name is Khalid Khan, and I'm part of Health Sciences'

私はカリド・カーンと申します

marketing team here at Waters.

ウォーターズのヘルスサイエンス部門の マーケティングチームに所属しています

Today, I will be presenting on peptide and protein structure.

今日は、ペプチドとタンパク質の構造について プレゼンテーションを行います

So let's get started.

では始めましょう

Here are a number of workflows for large molecule

ここにあるのは、高分子バイオ医薬品と

biotherapeutic and protein biomolecule analysis.

タンパク質生体分子測定のためのいくつかのワークフローです

Today, LC-MS is increasingly used for protein quantification

現在、伝統的なリガンド結合法に代わるものとして

as an alternative to traditional ligand binding assays.

LC-MSはタンパク質定量に使用されることが増えてきました

Proteins can be analyzed by LC-MS,

タンパク質はLC-MSによって分析することができます

either using intact protein or surrogate peptide workflows.

それは、インタクトタンパク質またはサロゲートペプチド いずれのワークフローを用いても可能です

Both tandem quadrupole and high resolution mass spectrometers

タンデム四重極型質量分析計と高分解能質量分析装置の

can be used.

両方を使用することができます

Normal flow and microflow LC systems

ノーマルフローおよびマイクロフローLCシステムもまた

are also commonly used with both of these mass spectrometer

それら両方の質量分析計システムと共に

systems.

一般的に使用されています

Most of this module will focus on the surrogate peptide

このモジュールの大部分は タンデム四重極型質量分析計を使用した

workflow using tandem mass spectrometers,

サロゲートペプチドワークフローに焦点を当てます

and understanding your peptides and protein structure

ペプチドとタンパク質の構造を理解することは

is important when developing both intact and surrogate

インタクトおよびサロゲートペプチドワークフローの 開発において

peptide workflows.

重要です

The areas covered in this presentation

本プレゼンテーションでは

will be the basic structure of amino acids,

アミノ酸、

peptides, and proteins, including

ペプチド、タンパク質の基本構造を扱い

a few specific examples, such as monoclonal antibodies.

モノクローナル抗体等の特定の例を含めてご紹介します

The basic structure of peptides and proteins

ペプチドとタンパク質の基本構造は

has an impact on both the sample treatment and LC-MS method

サンプル前処理とLC-MSメソッド開発の両方に

development.

影響を与えます

The ionization and fragmentation of peptides

ペプチドのイオン化およびフラグメンテーションと

and how these aspects differ from small molecules

それらが低分子とどのように異なるのかについても

will also be covered.

ご説明します

The presentation is mainly intended

本プレゼンテーションは

for scientists who already have some experience

低分子LC-MSメソッド開発においてある程度の経験を持つ

in small molecule LC-MS method development.

科学者の方を主な対象としています

Their aim is to provide an introduction to peptide

その目的はペプチドおよび

and protein structure and explain

タンパク質の構造をご紹介し

the commonly used terms in peptide protein LC-MS method

ペプチド、タンパク質LC-MSメソッド開発において 一般的に使用されている用語の解説と

development.

なっています

The presentation will also prepare you

また本プレゼンテーションは

for subsequent modules in the Waters Peptide and Protein

ウォーターズのペプチドおよびタンパク質のバイオアナリシス 短期集中講座の

Bioanalysis Boot Camp.

今後の章の基本情報にもなっています

In this first section, let's look at the structure

この最初のセクションでは

of peptides and proteins.

ペプチドとタンパク質の構造について見ていきましょう

Peptides and proteins are chains of amino acids joined together.

ペプチドとタンパク質はアミノ酸が鎖状に連結したものです

There is no agreed criteria that specifies

それがペプチドと呼ばれるのかタンパク質と呼ばれるのかを定義する

the length of an amino acid chain that defines whether it

アミノ酸の鎖の長さについての

is called a peptide or protein.

はっきりとした基準はありません

One common definition is that if the amino acid chain consists

1つの一般的な定義としては、もしアミノ酸の鎖が

of less than 50 amino acids, it is

50個未満であれば、それは

called a peptide, and more than 50 amino acids,

ペプチドと呼ばれ、50個以上であれば

it is called a protein.

それはタンパク質と呼ばれます

This definition is not absolute, and you

この定義は絶対的なものではなく

can have large peptides and small proteins

同じようなアミノ酸の鎖長でも

of similar amino acid chain lengths.

大きなペプチドや小さなタンパク質も存在します

All of human proteins are formed from just 20

人間の全タンパク質はわずか20種類の

naturally occurring amino acids, or 21,

天然に存在するアミノ酸で構成されており

if you include selenocysteine.

セレノシステインを含めても21種類です

In terms of molecular weight, peptides

分子量に関しては、ペプチドは

are typically less than 6000 daltons,

一般的に6,000 Da未満であり

whereas proteins can be anywhere from 5800

タンパク質は、インスリン等の小型のタンパク質では

daltons for a small protein such as insulin

5,800 Daほどから

or several hundred thousand daltons for large proteins

大型のタンパク質であるサイログロブリン等では数十万Daに上り

such thyroglobulin.

非常に広範囲にわたっています

This slide illustrates the mechanism

このスライドは2つのアミノ酸が

of how two amino acids join together

連結してペプチド結合をつくる仕組みを

to form a peptide bond.

表したものです

The carboxyl group of one amino acid

一方のアミノ酸のカルボキシル基が

reacts with the amine group of another amino acid

もう一方のアミノ酸のアミン基に反応することで

to form a peptide bond.

ペプチド結合を形成します

The resultant peptide will have a carboxyl group on one end,

そこで生じたペプチドは片方の末端にカルボキシル基を持ち

and this is referred to as the C-terminal end.

それはC末端と呼ばれています

The amine group is referred to as the N-terminal end.

アミノ基はN末端と呼ばれます

As we will see later, these peptide bonds

あとで見ていきますが、これらのペプチド結合は

fragment in a highly predictable manner in a mass spectrometer

質量分析計のコリジョンセル内における フラグメンテーションは容易に予測できます

collision cell.

アミノ酸とペプチドは双性イオンとして存在しています

Amino acids and peptides can exist as zwitterions.

つまり、これらは正電荷と負電荷の両方を持ち

This means that they can have both negative and positive

pHによって異なります

charges, depending on the pH.

これはペプチドレベルでの サンプルクリーンアップメソッド開発において

This is an important factor when developing sample clean up

重要な要素となります

methods at the peptide level.

これについては今後のモジュールでより詳しくご説明します

This will be discussed in more detail in later modules.

アミノ酸鎖はペプチドまたはタンパク質の骨格を形成し

The chain of amino acids that form the backbone of a peptide

これは一次構造と呼ばれています

or protein is referred to as its primary structure.

アミノ酸は通常1文字

Amino acids are usually represented by a single letter

または3文字の略語で表されます

or three letter abbreviation.

こちらは21種類のアミノ酸の表となっており

Here is the table of the 21 amino acids

これらによって人間のペプチドおよびタンパク質が形成されています

from which human peptides and proteins are formed.

1文字で表されるものの中でわかりやすい例としては

Some single letters are obvious, for example, G

Gはグリシンを表し、Aはアラニンを表します

for glycine and A for alanine.

すぐに分かりにくいものとしては、リジンを表すK、

Others are less obvious, such as K for lysine

アルギニンを表すRなどがあります

and R for arginine.

本プレゼンテーションで後に見ていきますが

As we will see later in this presentation,

リシンとアルギニンは特定の酵素分解を用いて

lysine and arginine are very important when

大きなタンパク質を小さなペプチドに分解する場合には

we discuss the breakdown of large proteins

とても重要になってきます

into smaller peptides using specific enzyme digestion.

このスライドはアミノ酸の非常に多様な構造と

This slide illustrates the wide variety of structures

結果として生じる化学的性質を表したものです

and resultant chemical properties of amino acids.

アミノ酸の化学構造は

The chemical structure of the amino acids

結果として生じたペプチドおよびタンパク質の極性、疎水性、

influences the polarity, hydrophobicity,

酸性および塩基性などの性質に

and acidic/basic nature of the resultant peptides

影響します

and proteins.

システインは硫黄原子を含んでいますが

Note that cysteine contains a sulfur atom, which

これはつまり2つのシステインが

means that two cysteine amino acids can form

ジスルフィド結合を起こす可能性があるということです

disulfide bonds between them.

これらのジスルフィド結合は、同じペプチド鎖の中で形成されたり

These disulfide bonds can form in the same peptide chains

2つの異なるペプチド鎖を結合させる可能性があります

or connect two different peptide chains.

先ほどお話ししたように、ペプチドとタンパク質の多様な性質が

I stated earlier that the diverse properties of peptides

サンプル前処理とLC-MSメソッド開発に

and proteins have a large impact on the sample pretreatment

大きな影響を与えます

and LC-MS method development.

アミノ酸には2つめのアミン基を持つものがあり

Note that some amino acids have a second amine group, which

これはつまりプロトン化を形成する場所を

means that they have multiple sites that

複数持つということになり

can be protonated to form multiply charged,

正の多価イオンを形成します

positive ions.

全てのアミノ酸の構造については詳細が明らかになっているため

As the structures of all amino acids are well known,

ペプチドの質量を

it is possible to calculate the mass of a peptide

そのアミノ酸成分から計算することが可能です。

from its amino acid constituents.

それらを手動で計算する必要はないので安心してください

Don't worry you will not have to calculate these manually.

ソフトウェアツールが自動で計算を行ってくれます

Software tools are available to do this automatically for you.

Skylineのようなソフトウェアツールは自動で

Software tools, such as Skyline, will automatically

アミノ酸配列からペプチドの分子量を

calculate the molecular weight of a peptide

計算します

from its amino acid sequence.

例えば、ペプチドD-E-V-I-Lは

For example, the peptide D-E-V-I-L,

アスパラギン酸、グルタミン酸、バリン、

which consists of aspartic acid, glutamic acid, valine,

イソロイシン、ロイシンで構成され、分子量は

isoleucine, and leucine, will have a mass of 587.31662

587.31662 Daです

daltons.

上記の表はモノアイソトピック質量および

Note that the table above lists the monoisotopic mass

平均質量を表しています

and average mass.

モノアイソトピック質量では

The monoisotopic mass is the mass where only the most

最も存在量の多い同位体のみが計算に使用されます

abundant isotopes are used in the calculation,

例としては、炭素12、水素1、酸素16となります

i.e., carbon-12, hydrogen-1, oxygen-16.

平均質量では全ての存在量の少ない同位体も

The average mass has all the minor isotopes

計算に含まれます。例としては炭素13、

also included in the calculation, i.e., carbon-13,

重水素、窒素15などがあります

deuterium, and nitrogen-15.

タンパク質は異なる形態および構造で存在します

Proteins can exist in different forms and structures.

ここまでは、基本的なアミノ酸配列のみをお話ししてきました

So far, we have only discussed the basic amino acid

これは一次構造と呼ばれているものです

sequence, which is referred to as the primary structure.

アミノ酸はお互いに水素結合を形成することが可能であり

Amino acids can form hydrogen bond interactions

それはペプチドやタンパク質の

between each other, which influences the shape

形状に影響します

of a peptide chain or protein.

最も一般的な構造はβシート（シート状）と αヘリックス（螺旋状）です

The most common structures are a pleated sheet and half a helix.

αヘリックスとβシート間の結合と相互作用は

Bonds and interaction between alpha helices

三次構造を生み出します

and pleated sheets result in tertiary structures.

システインとペプチド鎖の硫黄結合は

Sulfa bonds between cysteine amino acids

三次構造では一般的なものです

and the peptide chains are common in tertiary structures.

さらに、2種類以上のペプチド鎖が含まれると

Finally, when more than one different type of peptide chain

四次構造が生成されます

is involved, quaternary structure is produced.

このスライドはインスリンの一次構造を表しており

This slide illustrates the primary structure

インスリンA鎖とインスリンB鎖の

of insulin, which includes two amino acid chains joined

2つのアミノ酸鎖が連結しています

together, the insulin A chain and the insulin B chain.

このスライドのダイアグラムには

The diagram on this slide also shows

インスリンの三次構造が示されています

a diagram of the tertiary structure of insulin.

ここにペプチド薬のデスモプレシンの例があります

Here is an example of a peptide drug, desmopressin.

これは比較的小さなペプチドで

This is a relatively small peptide

9つのアミノ酸で構成されています

comprised of nine amino acids.

この長さのペプチドのLC-MSメソッドは

LC-MS development of a peptide of this length

低分子のLC-MSメソッドと同様に

can be treated in the same way as a small molecule LC-MS

扱われます

method.

このペプチドは直接

The peptide can be analyzed directly

LC-MSおよびMRMメソッド開発で用いられる標準品で

by LC-MS and standards that are available for MRM method

分析できます

development.

低分子ESIマススペクトルとの1つの違いは

One difference from a small molecule ESI mass spectrum

一価イオンに加えて

is the presence of a doubly charged positive ion

二価の正イオンが存在することです

in addition to the singly charged ion.

これについては本プレゼンテーションと後の章でお話ししますが

This is a key feature of peptide ionization

ペプチドイオン化における重要な

that will be discussed later in this presentation

特徴です

and other modules.

二価イオンは535.22であり

Note the doubly charged ion at 535.22

一価イオンは1,069.435です

and the singly charged ion at 1069.435.

小型タンパク質の一例はインスリンであり

An example of a small protein is insulin, which

51のアミノ酸で構成されています

consists of 51 amino acids.

A鎖には21個のアミノ酸が、B鎖には

The A chain has 21 amino acids, and the B chain

30個のアミノ酸が含まれます

is 30 amino acids.

インスリンのモノアイソトピック質量は

The monoisotopic mass of insulin is

5,023.6377であり

5023.6377, which is outside the range

これは一般的な測定上限が2,000 Da以下である

of tandem quadrupole mass spectrometer systems which

タンデム四重極型質量分析計システムの測定範囲を超えています

typically have a maximum upper range of below 2000 daltons.

しかし、インスリンは三、四、五価の

However, as insulin forms multiply charged ions

多価イオンを形成するため

with three, four, and five charges,

タンデム四重極型質量分析計を用いて分析が可能です

it can be analyzed using tandem mass spectrometers.

この例では、五価の正イオンが質量1,162となります

In this example, the five plus ion is shown at mass 1162.

インスリンはまた三価と四価の正イオンを形成します

Insulin also forms three plus and four plus ions.

ここでも注意すべき点は、ジスルフィド結合は2つのアミノ酸が存在する

Note again the disulfide bonds connecting the two amino acid

アミノ酸鎖を接続するということです

chains between two existing amino acids.

これらは非常に一般的なタンパク質構造です

These are very common protein structures.

こちらの例は大型のタンパク質

Here are some examples of larger proteins,

分子量7,649の

ranging from insulin like growth factor IGF-1

インスリン様成長因子IGF-1や

with the molecular weight of 7649

分子量660,000 Da以上のサイログロブリン

to thyroglobulin, which has a molecular weight over 660,000

となります

daltons.

このスライドには中型のタンパク質である

The slide also shows medium sized proteins,

CRPやアポリポプロテインA1が例として挙げられており

such as CRP and apolipoprotein A1, which

20,000 Da中盤の分子量を持っています

have molecular weight in the mid 20,000 dalton range.

タンパク質のサイズが大きくなればなるほど

We can see that as the size of the proteins

インタクトタンパクの測定はより困難になり

increase, the challenge of measuring the intact protein

範囲が限定されたタンデム四重極型質量分析計では

gets more difficult and is virtually

実質的に測定不可能であることがわかります

impossible using limited range tandem mass spectrometers.

しかし、大型のタンパク質を小型のペプチド単位に分解し

However, we can break down large proteins into smaller peptide

それらのペプチドをタンデム四重極型質量分析計を使って 分析することは

units and analyze these peptides using tandem mass

可能です

spectrometers.

これはサロゲートペプチドアプローチと呼ばれ

This approach is called a surrogate peptide approach

タンパク質のバイオアナリシスおよびタンパク質バイオマーカー研究では

and is widely used in protein bioanalysis and protein

幅広く用いられています

biomarker research.

抗体は共通構造を持ったタンパク質の

Antibodies are a specific class of proteins

特定の分類となります

with a common structure.

抗体は大きなY字型のタンパク質で、2つの重鎖と

They are large Y-shaped proteins with two heavy chains and two

2つの軽鎖で構成されています

light chains.

重鎖はジスルフィド結合によって連結されています

The heavy chains are linked to each other by disulfide bonds.

ジスルフィド結合は軽鎖と重鎖も連結させています

Sulfa bonds also link the light chains with the heavy chains.

人間の免疫グロブリンと抗体は

Human immunoglobulins and antibody

感染症と戦うための白血球細胞により作られます

produce white plasma cells to fight infections.

重鎖には約440のアミノ酸が含まれ

The heavy chains contains approximately 440 amino acids,

軽鎖には約220のアミノ酸が含まれています

and the light chains contain 220 amino acids.

モノクローナル抗体薬は現在非常に重要な治療法のひとつであり

Monoclonal antibody drugs now form a very important class

生体医学研究および

of therapeutics and need to be measured in biomedical studies

臨床研究が必要とされています

and clinical research studies.

現在最も広範に使用されているモノクローナル抗体薬のひとつは

One of the most widely used monoclonal antibody drugs

インフリキシマブで、これは

today is infliximab, which is used

クローン病などの自己免疫疾患の治療に用いられています

to treat autoimmune conditions such as Crohn's disease.

インフリキシマブはTNF-αに結合し

Infliximab binds to TNF alpha and has

分子量は約150,000 Daです

a molecular weight of approximately 150,000 daltons.

インフリキシマブはキメラ抗体と呼ばれています

Infliximab is known as a chimeric antibody.

インフリキシマブはTNF-αと結合します

Infliximab binds to TNF alpha.

インフリキシマブはキメラ抗体です

And infliximab is a chimeric antibody.

では数十万Daの大型タンパク質を

So how do we analyze large proteins

通常2,000Da未満という限定された質量しか測定できない

of several thousand daltons using tandem quadrupole mass

タンデム四重極型質量分析計を使ってどのように

spectrometers which usually have a limited mass range of less

分析すればよいのでしょうか

than 2000 daltons.

用いられるアプローチは、酵素を用いてタンパク質を

The approach used is to break down the proteins

小型のペプチドに分解するというものです

into smaller peptides using digestion with enzymes.

様々な酵素が用いられます

A number of different enzymes are used.

最も一般的に使用される酵素はトリプシンで

The most commonly used enzyme is trypsin,

タンパク質の特定の場所を開裂します

which cleaves proteins in very specific locations.

トリプシンは、リシンとアルギニンに隣接するタンパク質を

Trypsin cleaves proteins adjacent to lysine

開裂します

and arginine.

開裂は常にアミノ酸のC末端で

Cleavage is always on the c-terminal side

発生します

of the amino acid.

つまり、トリプシン消化によって発生するペプチドである

This means that peptides arising from trypsin digestion, which

トリプティックペプチドが

are called triptych peptides, can

そのタンパク質のアミノ酸配列から予測できるということになります

be predicted from the amino acid sequence of the protein.

オンラインのソフトウェアツールによって

Online software tools are available to predict

トリプティックペプチドが予測できます

triptych peptides.

またこれらのオンラインツールは、それらペプチドの

These online tools also predict the fragmentation

質量分析計でのフラグメンテーションも予測できます

of those peptides in a mass spectrometer.

これはサロゲートペプチドアプローチの基本であり

This is the basis of the surrogate peptide approach,

ペプチドの由来となったタンパク質の

where a peptide or peptides are quantified

代理として、ペプチドが

as a surrogate for the proteins from which

定量化されます

the peptides were derived from.

特定のケースでは、タンパク質はトリプシン等の酵素で