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  • Hello and welcome to the next module

    こんにちは ウォーターズのペプチドおよびタンパク質のバイオアナリシス

  • in the Waters Peptide and Protein Bioanalysis Boot Camp.

    短期集中講座の次章へようこそ

  • My name is Khalid Khan, and I'm part of Health Sciences'

    私はカリド・カーンと申します

  • marketing team here at Waters.

    ウォーターズのヘルスサイエンス部門の マーケティングチームに所属しています

  • Today, I will be presenting on peptide and protein structure.

    今日は、ペプチドとタンパク質の構造について プレゼンテーションを行います

  • So let's get started.

    では始めましょう

  • Here are a number of workflows for large molecule

    ここにあるのは、高分子バイオ医薬品と

  • biotherapeutic and protein biomolecule analysis.

    タンパク質生体分子測定のためのいくつかのワークフローです

  • Today, LC-MS is increasingly used for protein quantification

    現在、伝統的なリガンド結合法に代わるものとして

  • as an alternative to traditional ligand binding assays.

    LC-MSはタンパク質定量に使用されることが増えてきました

  • Proteins can be analyzed by LC-MS,

    タンパク質はLC-MSによって分析することができます

  • either using intact protein or surrogate peptide workflows.

    それは、インタクトタンパク質またはサロゲートペプチド いずれのワークフローを用いても可能です

  • Both tandem quadrupole and high resolution mass spectrometers

    タンデム四重極型質量分析計と高分解能質量分析装置の

  • can be used.

    両方を使用することができます

  • Normal flow and microflow LC systems

    ノーマルフローおよびマイクロフローLCシステムもまた

  • are also commonly used with both of these mass spectrometer

    それら両方の質量分析計システムと共に

  • systems.

    一般的に使用されています

  • Most of this module will focus on the surrogate peptide

    このモジュールの大部分は タンデム四重極型質量分析計を使用した

  • workflow using tandem mass spectrometers,

    サロゲートペプチドワークフローに焦点を当てます

  • and understanding your peptides and protein structure

    ペプチドとタンパク質の構造を理解することは

  • is important when developing both intact and surrogate

    インタクトおよびサロゲートペプチドワークフローの 開発において

  • peptide workflows.

    重要です

  • The areas covered in this presentation

    本プレゼンテーションでは

  • will be the basic structure of amino acids,

    アミノ酸、

  • peptides, and proteins, including

    ペプチド、タンパク質の基本構造を扱い

  • a few specific examples, such as monoclonal antibodies.

    モノクローナル抗体等の特定の例を含めてご紹介します

  • The basic structure of peptides and proteins

    ペプチドとタンパク質の基本構造は

  • has an impact on both the sample treatment and LC-MS method

    サンプル前処理とLC-MSメソッド開発の両方に

  • development.

    影響を与えます

  • The ionization and fragmentation of peptides

    ペプチドのイオン化およびフラグメンテーションと

  • and how these aspects differ from small molecules

    それらが低分子とどのように異なるのかについても

  • will also be covered.

    ご説明します

  • The presentation is mainly intended

    本プレゼンテーションは

  • for scientists who already have some experience

    低分子LC-MSメソッド開発においてある程度の経験を持つ

  • in small molecule LC-MS method development.

    科学者の方を主な対象としています

  • Their aim is to provide an introduction to peptide

    その目的はペプチドおよび

  • and protein structure and explain

    タンパク質の構造をご紹介し

  • the commonly used terms in peptide protein LC-MS method

    ペプチド、タンパク質LC-MSメソッド開発において 一般的に使用されている用語の解説と

  • development.

    なっています

  • The presentation will also prepare you

    また本プレゼンテーションは

  • for subsequent modules in the Waters Peptide and Protein

    ウォーターズのペプチドおよびタンパク質のバイオアナリシス 短期集中講座の

  • Bioanalysis Boot Camp.

    今後の章の基本情報にもなっています

  • In this first section, let's look at the structure

    この最初のセクションでは

  • of peptides and proteins.

    ペプチドとタンパク質の構造について見ていきましょう

  • Peptides and proteins are chains of amino acids joined together.

    ペプチドとタンパク質はアミノ酸が鎖状に連結したものです

  • There is no agreed criteria that specifies

    それがペプチドと呼ばれるのかタンパク質と呼ばれるのかを定義する

  • the length of an amino acid chain that defines whether it

    アミノ酸の鎖の長さについての

  • is called a peptide or protein.

    はっきりとした基準はありません

  • One common definition is that if the amino acid chain consists

    1つの一般的な定義としては、もしアミノ酸の鎖が

  • of less than 50 amino acids, it is

    50個未満であれば、それは

  • called a peptide, and more than 50 amino acids,

    ペプチドと呼ばれ、50個以上であれば

  • it is called a protein.

    それはタンパク質と呼ばれます

  • This definition is not absolute, and you

    この定義は絶対的なものではなく

  • can have large peptides and small proteins

    同じようなアミノ酸の鎖長でも

  • of similar amino acid chain lengths.

    大きなペプチドや小さなタンパク質も存在します

  • All of human proteins are formed from just 20

    人間の全タンパク質はわずか20種類の

  • naturally occurring amino acids, or 21,

    天然に存在するアミノ酸で構成されており

  • if you include selenocysteine.

    セレノシステインを含めても21種類です

  • In terms of molecular weight, peptides

    分子量に関しては、ペプチドは

  • are typically less than 6000 daltons,

    一般的に6,000 Da未満であり

  • whereas proteins can be anywhere from 5800

    タンパク質は、インスリン等の小型のタンパク質では

  • daltons for a small protein such as insulin

    5,800 Daほどから

  • or several hundred thousand daltons for large proteins

    大型のタンパク質であるサイログロブリン等では数十万Daに上り

  • such thyroglobulin.

    非常に広範囲にわたっています

  • This slide illustrates the mechanism

    このスライドは2つのアミノ酸が

  • of how two amino acids join together

    連結してペプチド結合をつくる仕組みを

  • to form a peptide bond.

    表したものです

  • The carboxyl group of one amino acid

    一方のアミノ酸のカルボキシル基が

  • reacts with the amine group of another amino acid

    もう一方のアミノ酸のアミン基に反応することで

  • to form a peptide bond.

    ペプチド結合を形成します

  • The resultant peptide will have a carboxyl group on one end,

    そこで生じたペプチドは片方の末端にカルボキシル基を持ち

  • and this is referred to as the C-terminal end.

    それはC末端と呼ばれています

  • The amine group is referred to as the N-terminal end.

    アミノ基はN末端と呼ばれます

  • As we will see later, these peptide bonds

    あとで見ていきますが、これらのペプチド結合は

  • fragment in a highly predictable manner in a mass spectrometer

    質量分析計のコリジョンセル内における フラグメンテーションは容易に予測できます

  • collision cell.

    アミノ酸とペプチドは双性イオンとして存在しています

  • Amino acids and peptides can exist as zwitterions.

    つまり、これらは正電荷と負電荷の両方を持ち

  • This means that they can have both negative and positive

    pHによって異なります

  • charges, depending on the pH.

    これはペプチドレベルでの サンプルクリーンアップメソッド開発において

  • This is an important factor when developing sample clean up

    重要な要素となります

  • methods at the peptide level.

    これについては今後のモジュールでより詳しくご説明します

  • This will be discussed in more detail in later modules.

    アミノ酸鎖はペプチドまたはタンパク質の骨格を形成し

  • The chain of amino acids that form the backbone of a peptide

    これは一次構造と呼ばれています

  • or protein is referred to as its primary structure.

    アミノ酸は通常1文字

  • Amino acids are usually represented by a single letter

    または3文字の略語で表されます

  • or three letter abbreviation.

    こちらは21種類のアミノ酸の表となっており

  • Here is the table of the 21 amino acids

    これらによって人間のペプチドおよびタンパク質が形成されています

  • from which human peptides and proteins are formed.

    1文字で表されるものの中でわかりやすい例としては

  • Some single letters are obvious, for example, G

    Gはグリシンを表し、Aはアラニンを表します

  • for glycine and A for alanine.

    すぐに分かりにくいものとしては、リジンを表すK、

  • Others are less obvious, such as K for lysine

    アルギニンを表すRなどがあります

  • and R for arginine.

    本プレゼンテーションで後に見ていきますが

  • As we will see later in this presentation,

    リシンとアルギニンは特定の酵素分解を用いて

  • lysine and arginine are very important when

    大きなタンパク質を小さなペプチドに分解する場合には

  • we discuss the breakdown of large proteins

    とても重要になってきます

  • into smaller peptides using specific enzyme digestion.

    このスライドはアミノ酸の非常に多様な構造と

  • This slide illustrates the wide variety of structures

    結果として生じる化学的性質を表したものです

  • and resultant chemical properties of amino acids.

    アミノ酸の化学構造は

  • The chemical structure of the amino acids

    結果として生じたペプチドおよびタンパク質の極性、疎水性、

  • influences the polarity, hydrophobicity,

    酸性および塩基性などの性質に

  • and acidic/basic nature of the resultant peptides

    影響します

  • and proteins.

    システインは硫黄原子を含んでいますが

  • Note that cysteine contains a sulfur atom, which

    これはつまり2つのシステインが

  • means that two cysteine amino acids can form

    ジスルフィド結合を起こす可能性があるということです

  • disulfide bonds between them.

    これらのジスルフィド結合は、同じペプチド鎖の中で形成されたり

  • These disulfide bonds can form in the same peptide chains

    2つの異なるペプチド鎖を結合させる可能性があります

  • or connect two different peptide chains.

    先ほどお話ししたように、ペプチドとタンパク質の多様な性質が

  • I stated earlier that the diverse properties of peptides

    サンプル前処理とLC-MSメソッド開発に

  • and proteins have a large impact on the sample pretreatment

    大きな影響を与えます

  • and LC-MS method development.

    アミノ酸には2つめのアミン基を持つものがあり

  • Note that some amino acids have a second amine group, which

    これはつまりプロトン化を形成する場所を

  • means that they have multiple sites that

    複数持つということになり

  • can be protonated to form multiply charged,

    正の多価イオンを形成します

  • positive ions.

    全てのアミノ酸の構造については詳細が明らかになっているため

  • As the structures of all amino acids are well known,

    ペプチドの質量を

  • it is possible to calculate the mass of a peptide

    そのアミノ酸成分から計算することが可能です。

  • from its amino acid constituents.

    それらを手動で計算する必要はないので安心してください

  • Don't worry you will not have to calculate these manually.

    ソフトウェアツールが自動で計算を行ってくれます

  • Software tools are available to do this automatically for you.

    Skylineのようなソフトウェアツールは自動で

  • Software tools, such as Skyline, will automatically

    アミノ酸配列からペプチドの分子量を

  • calculate the molecular weight of a peptide

    計算します

  • from its amino acid sequence.

    例えば、ペプチドD-E-V-I-Lは

  • For example, the peptide D-E-V-I-L,

    アスパラギン酸、グルタミン酸、バリン、

  • which consists of aspartic acid, glutamic acid, valine,

    イソロイシン、ロイシンで構成され、分子量は

  • isoleucine, and leucine, will have a mass of 587.31662

    587.31662 Daです

  • daltons.

    上記の表はモノアイソトピック質量および

  • Note that the table above lists the monoisotopic mass

    平均質量を表しています

  • and average mass.

    モノアイソトピック質量では

  • The monoisotopic mass is the mass where only the most

    最も存在量の多い同位体のみが計算に使用されます

  • abundant isotopes are used in the calculation,

    例としては、炭素12、水素1、酸素16となります

  • i.e., carbon-12, hydrogen-1, oxygen-16.

    平均質量では全ての存在量の少ない同位体も

  • The average mass has all the minor isotopes

    計算に含まれます。例としては炭素13、

  • also included in the calculation, i.e., carbon-13,

    重水素、窒素15などがあります

  • deuterium, and nitrogen-15.

    タンパク質は異なる形態および構造で存在します

  • Proteins can exist in different forms and structures.

    ここまでは、基本的なアミノ酸配列のみをお話ししてきました

  • So far, we have only discussed the basic amino acid

    これは一次構造と呼ばれているものです

  • sequence, which is referred to as the primary structure.

    アミノ酸はお互いに水素結合を形成することが可能であり

  • Amino acids can form hydrogen bond interactions

    それはペプチドやタンパク質の

  • between each other, which influences the shape

    形状に影響します

  • of a peptide chain or protein.

    最も一般的な構造はβシート(シート状)と αヘリックス(螺旋状)です

  • The most common structures are a pleated sheet and half a helix.

    αヘリックスとβシート間の結合と相互作用は

  • Bonds and interaction between alpha helices

    三次構造を生み出します

  • and pleated sheets result in tertiary structures.

    システインとペプチド鎖の硫黄結合は

  • Sulfa bonds between cysteine amino acids

    三次構造では一般的なものです

  • and the peptide chains are common in tertiary structures.

    さらに、2種類以上のペプチド鎖が含まれると

  • Finally, when more than one different type of peptide chain

    四次構造が生成されます

  • is involved, quaternary structure is produced.

    このスライドはインスリンの一次構造を表しており

  • This slide illustrates the primary structure

    インスリンA鎖とインスリンB鎖の

  • of insulin, which includes two amino acid chains joined

    2つのアミノ酸鎖が連結しています

  • together, the insulin A chain and the insulin B chain.

    このスライドのダイアグラムには

  • The diagram on this slide also shows

    インスリンの三次構造が示されています

  • a diagram of the tertiary structure of insulin.

    ここにペプチド薬のデスモプレシンの例があります

  • Here is an example of a peptide drug, desmopressin.

    これは比較的小さなペプチドで

  • This is a relatively small peptide

    9つのアミノ酸で構成されています

  • comprised of nine amino acids.

    この長さのペプチドのLC-MSメソッドは

  • LC-MS development of a peptide of this length

    低分子のLC-MSメソッドと同様に

  • can be treated in the same way as a small molecule LC-MS

    扱われます

  • method.

    このペプチドは直接

  • The peptide can be analyzed directly

    LC-MSおよびMRMメソッド開発で用いられる標準品で

  • by LC-MS and standards that are available for MRM method

    分析できます

  • development.

    低分子ESIマススペクトルとの1つの違いは

  • One difference from a small molecule ESI mass spectrum

    一価イオンに加えて

  • is the presence of a doubly charged positive ion

    二価の正イオンが存在することです

  • in addition to the singly charged ion.

    これについては本プレゼンテーションと後の章でお話ししますが

  • This is a key feature of peptide ionization

    ペプチドイオン化における重要な

  • that will be discussed later in this presentation

    特徴です

  • and other modules.

    二価イオンは535.22であり

  • Note the doubly charged ion at 535.22

    一価イオンは1,069.435です

  • and the singly charged ion at 1069.435.

    小型タンパク質の一例はインスリンであり

  • An example of a small protein is insulin, which

    51のアミノ酸で構成されています

  • consists of 51 amino acids.

    A鎖には21個のアミノ酸が、B鎖には

  • The A chain has 21 amino acids, and the B chain

    30個のアミノ酸が含まれます

  • is 30 amino acids.

    インスリンのモノアイソトピック質量は

  • The monoisotopic mass of insulin is

    5,023.6377であり

  • 5023.6377, which is outside the range

    これは一般的な測定上限が2,000 Da以下である

  • of tandem quadrupole mass spectrometer systems which

    タンデム四重極型質量分析計システムの測定範囲を超えています

  • typically have a maximum upper range of below 2000 daltons.

    しかし、インスリンは三、四、五価の

  • However, as insulin forms multiply charged ions

    多価イオンを形成するため

  • with three, four, and five charges,

    タンデム四重極型質量分析計を用いて分析が可能です

  • it can be analyzed using tandem mass spectrometers.

    この例では、五価の正イオンが質量1,162となります

  • In this example, the five plus ion is shown at mass 1162.

    インスリンはまた三価と四価の正イオンを形成します

  • Insulin also forms three plus and four plus ions.

    ここでも注意すべき点は、ジスルフィド結合は2つのアミノ酸が存在する

  • Note again the disulfide bonds connecting the two amino acid

    アミノ酸鎖を接続するということです

  • chains between two existing amino acids.

    これらは非常に一般的なタンパク質構造です

  • These are very common protein structures.

    こちらの例は大型のタンパク質

  • Here are some examples of larger proteins,

    分子量7,649の

  • ranging from insulin like growth factor IGF-1

    インスリン様成長因子IGF-1や

  • with the molecular weight of 7649

    分子量660,000 Da以上のサイログロブリン

  • to thyroglobulin, which has a molecular weight over 660,000

    となります

  • daltons.

    このスライドには中型のタンパク質である

  • The slide also shows medium sized proteins,

    CRPやアポリポプロテインA1が例として挙げられており

  • such as CRP and apolipoprotein A1, which

    20,000 Da中盤の分子量を持っています

  • have molecular weight in the mid 20,000 dalton range.

    タンパク質のサイズが大きくなればなるほど

  • We can see that as the size of the proteins

    インタクトタンパクの測定はより困難になり

  • increase, the challenge of measuring the intact protein

    範囲が限定されたタンデム四重極型質量分析計では

  • gets more difficult and is virtually

    実質的に測定不可能であることがわかります

  • impossible using limited range tandem mass spectrometers.

    しかし、大型のタンパク質を小型のペプチド単位に分解し

  • However, we can break down large proteins into smaller peptide

    それらのペプチドをタンデム四重極型質量分析計を使って 分析することは

  • units and analyze these peptides using tandem mass

    可能です

  • spectrometers.

    これはサロゲートペプチドアプローチと呼ばれ

  • This approach is called a surrogate peptide approach

    タンパク質のバイオアナリシスおよびタンパク質バイオマーカー研究では

  • and is widely used in protein bioanalysis and protein

    幅広く用いられています

  • biomarker research.

    抗体は共通構造を持ったタンパク質の

  • Antibodies are a specific class of proteins

    特定の分類となります

  • with a common structure.

    抗体は大きなY字型のタンパク質で、2つの重鎖と

  • They are large Y-shaped proteins with two heavy chains and two

    2つの軽鎖で構成されています

  • light chains.

    重鎖はジスルフィド結合によって連結されています

  • The heavy chains are linked to each other by disulfide bonds.

    ジスルフィド結合は軽鎖と重鎖も連結させています

  • Sulfa bonds also link the light chains with the heavy chains.

    人間の免疫グロブリンと抗体は

  • Human immunoglobulins and antibody

    感染症と戦うための白血球細胞により作られます

  • produce white plasma cells to fight infections.

    重鎖には約440のアミノ酸が含まれ

  • The heavy chains contains approximately 440 amino acids,

    軽鎖には約220のアミノ酸が含まれています

  • and the light chains contain 220 amino acids.

    モノクローナル抗体薬は現在非常に重要な治療法のひとつであり

  • Monoclonal antibody drugs now form a very important class

    生体医学研究および

  • of therapeutics and need to be measured in biomedical studies

    臨床研究が必要とされています

  • and clinical research studies.

    現在最も広範に使用されているモノクローナル抗体薬のひとつは

  • One of the most widely used monoclonal antibody drugs

    インフリキシマブで、これは

  • today is infliximab, which is used

    クローン病などの自己免疫疾患の治療に用いられています

  • to treat autoimmune conditions such as Crohn's disease.

    インフリキシマブはTNF-αに結合し

  • Infliximab binds to TNF alpha and has

    分子量は約150,000 Daです

  • a molecular weight of approximately 150,000 daltons.

    インフリキシマブはキメラ抗体と呼ばれています

  • Infliximab is known as a chimeric antibody.

    インフリキシマブはTNF-αと結合します

  • Infliximab binds to TNF alpha.

    インフリキシマブはキメラ抗体です

  • And infliximab is a chimeric antibody.

    では数十万Daの大型タンパク質を

  • So how do we analyze large proteins

    通常2,000Da未満という限定された質量しか測定できない

  • of several thousand daltons using tandem quadrupole mass

    タンデム四重極型質量分析計を使ってどのように

  • spectrometers which usually have a limited mass range of less

    分析すればよいのでしょうか

  • than 2000 daltons.

    用いられるアプローチは、酵素を用いてタンパク質を

  • The approach used is to break down the proteins

    小型のペプチドに分解するというものです

  • into smaller peptides using digestion with enzymes.

    様々な酵素が用いられます

  • A number of different enzymes are used.

    最も一般的に使用される酵素はトリプシンで

  • The most commonly used enzyme is trypsin,

    タンパク質の特定の場所を開裂します

  • which cleaves proteins in very specific locations.

    トリプシンは、リシンとアルギニンに隣接するタンパク質を

  • Trypsin cleaves proteins adjacent to lysine

    開裂します

  • and arginine.

    開裂は常にアミノ酸のC末端で

  • Cleavage is always on the c-terminal side

    発生します

  • of the amino acid.

    つまり、トリプシン消化によって発生するペプチドである

  • This means that peptides arising from trypsin digestion, which

    トリプティックペプチドが

  • are called triptych peptides, can

    そのタンパク質のアミノ酸配列から予測できるということになります

  • be predicted from the amino acid sequence of the protein.

    オンラインのソフトウェアツールによって

  • Online software tools are available to predict

    トリプティックペプチドが予測できます

  • triptych peptides.

    またこれらのオンラインツールは、それらペプチドの

  • These online tools also predict the fragmentation

    質量分析計でのフラグメンテーションも予測できます

  • of those peptides in a mass spectrometer.

    これはサロゲートペプチドアプローチの基本であり

  • This is the basis